中性粒细胞注释不再只看检出率：同一套注释流程，换一条质控规则就让9对患者中只剩3对显示下降
核心概要
中性粒细胞在单细胞数据里能被标出多少，并不等于样本组成估得准。研究用四个公开队列的蛋白测量与物理分选标签作独立参照，检验固定的注释流程和两条预设质控规则：在冻结质控下，SingleR 在配对全血蛋白阳性细胞中回收 99.10%，并在全部 9 对患者中估出中性粒细胞比例下降；改用另一条质控规则后，同一流程只在 3 对中估出下降，平均配对变化为 +0.12 个百分点。差异主要来自被筛掉的那部分细胞，而不是注释器本身。
深度剖析
判断一份单细胞注释流程好不好，不能只看它标出了多少目标细胞，还要看它同时误标了多少阴性对照、以及把多少构成分母的细胞留了下来。 此前提高中性粒细胞检出通常被当作分析改进的标志，而检出增加本身并不说明这些标签与独立测量一致。 四个公开队列合计 629,185 个源保留细胞、99 个计算分区，蛋白参照只用测得的抗体计数构建，不掺入 RNA 值、RNA 预测标签或患者结局。
在配对全血样本上，同一套注释流程给出的患者间变化方向，会随质控规则改变。 冻结质控下，剪枝后的 SingleR 在 9 对急性—恢复期患者中全部估出中性粒细胞比例下降，平均变化 −17.20 个百分点，描述性患者自助 95% 区间为 −20.30 至 −14.35。 把同一条替代质控规则原样套到同一批 RNA 数据上，SingleR 只在 3 对中估出下降，平均配对变化 +0.12 个百分点，区间 −0.45 至 +0.66；固定源细胞预测、只换质控掩码，就把平均配对估计推移了 +18.77 个百分点，重新计算依赖查询的剪枝只再贡献 +0.25 个百分点。
注释流程的回收能力要在多种独立参照下分别核对，因为不同参照回答的是不同问题。 全血蛋白参照之外，物理分选和组织的蛋白测量提供了另外两类阳性与阴性对照。 在 103 个物理分选的成熟中性粒细胞中，剪枝 SingleR 回收 99 个（96.12%），M4 回收 50 个（48.54%）；在斑块组织的 68 个蛋白阳性细胞中，SingleR 回收 42 个（61.76%），M4 回收 16 个（23.53%），两种 CellTypist 模型均未回收阳性，而四种流程在 6,267 个保留阴性对照中都没有给出中性粒细胞标签。
启示与展望
结论建立在四个公开人类单细胞队列的重分析上，蛋白参照给出的是操作性的高置信分区，全血面板不含 CD66b 与同型对照，斑块阳性分区每例仅 4 至 29 个细胞。适用场景是中性粒细胞组成研究以及其它丰度由筛选后单细胞样本推断的稀有或技术敏感细胞群。
蛋白参照并未判定每一个细胞，若让全部未判定细胞任取一种身份，9 对全样本配对区间都跨过零，这些是参照覆盖范围而非抽样置信区间。9 对临床配对中有 6 对更换了处理批次，同批次的只有 3 对；物理分选别名不能当作跨谱系同一批人；ABC 阴性对照中的不一致主要出现在 230 个 NK 分选细胞里，计算双细胞限制一般未能消解。