深度学习设计的小蛋白Denasin1在小鼠卒中模型把梗死体积从19.5%降到8.6%
核心概要
酸敏感离子通道hASIC1a在缺血时被持续激活并推动神经元死亡，但小分子抑制剂缺乏选择性或效力，毒液肽则受pH依赖性和二硫键生产限制。研究者用RFdiffusion生成骨架、ProteinMPNN分配序列、AlphaFold2筛选，从约1.2万个骨架和7万个序列中选出76个候选，经自动膜片钳筛出44氨基酸的Denasin1。该小蛋白在溶液中无序，结合后折叠为螺旋-转角-螺旋，对hASIC1a的IC50为23±2.5 nM，并在小鼠短暂性大脑中动脉闭塞模型中把梗死体积从19.5±9%降至8.6±5.4%。
深度剖析
一种由深度学习设计的小蛋白能在缺血性卒中模型中减小脑梗死体积，且效果超过已知的毒液来源hASIC1a抑制剂。 此前针对hASIC1a的候选包括小分子、毒液肽PcTx1与Hi1a以及抗体ASC06-IgG1，分别受制于选择性或效力不足、pH依赖性药理学与多对可还原二硫键带来的量产困难、生产成本高与组织穿透受限。 在小鼠短暂性大脑中动脉闭塞模型中，再灌注15分钟后鞘内给药，24小时后用TTC染色定量：Denasin1组梗死体积为8.6±5.4%（n=16），载体aCSF组为19.5±9%（n=16），PcTx1组为13.1±6.6%（n=16），Denasin1显著低于PcTx1。
候选小蛋白不是从化合物库中筛出来的，而是先由生成模型围绕hASIC1a胞外域酸性口袋上的疏水热点F352设计，再交给电生理实验判定功能。 常规高通量筛选需要从数百万分子的库中寻找先导物，而这里第一轮只表达纯化了76个设计候选。 设计流程用RFdiffusion在固定结构和热点约束下生成骨架，ProteinMPNN为每个骨架分配6条序列，AlphaFold2按pLDDT>85与界面pAE<14 Å过滤，共产生约1.2万个骨架、7万个序列，保留76个候选；自动膜片钳单剂量筛选中Denasin1与Denasin2抑制超过50%。
Denasin1在溶液中基本无序，只有接触通道时才折叠成设计预测的螺旋-转角-螺旋构象。 圆二色谱显示其螺旋含量低于10%，而同样设计出的Denasin2在加热到95°C后仍保持95%以上的螺旋度。 在MSP1D1纳米盘中重构的hASIC1a与Denasin1复合物经单颗粒冷冻电镜解析，单protomer（C1）重构分辨率为2.7 Å，三聚体（C3）为2.73 Å，密度图显示结合态为预测的螺旋-转角-螺旋折叠，界面以F352与Denasin1的Y36边对面芳香作用为中心。
启示与展望
已展示的范围是：在HEK细胞自动膜片钳与爪蟾卵母细胞双电极电压钳中验证的hASIC1a抑制与亚型选择性，在MSP1D1纳米盘中解析的结合态结构，以及成年雄性C57BL/6J小鼠30分钟闭塞后鞘内给药的短暂性大脑中动脉闭塞模型；作者明确说明鞘内给药只是建立概念验证的直接途径，并非临床给药策略。
作者指出计算打分不能假定会转化为功能调节或在体效力，Denasin1在测试设计中pAE分数偏差；第一轮命中率约3%，第二轮骨架富集后升至32%；Denasin1与Denasin2结合同一区域却功能表现不同，作者将其归因于ASIC门控的pH依赖性与变构耦合复杂性；药代性质、血浆与中枢神经系统半衰期、生物流体稳定性、毒性及血脑屏障穿透仍待研究。