纳米孔直接读tRNA不再先转成碱基序列：tyCooNN按电流信号分类，大肠杆菌48种tRNA准确率98.2%
核心概要
纳米孔直接RNA测序读tRNA时，修饰会干扰碱基识别，使序列比对在准确率与可用读段数之间难以兼顾。tyCooNN（nano tRNA classifier）改为直接以离子电流信号分类tRNA，绕开碱基识别与序列比对；对大肠杆菌全部48种tRNA，ntc48模型分类准确率为98.2%。研究还用44种tRNA的等摩尔混合物标定并校正读段计数偏差，据此给出各tRNA的绝对丰度，并以二分类器在单分子水平判别特定修饰。
深度剖析
纳米孔直接RNA测序的tRNA读段可以不经碱基识别、不经序列比对，直接按离子电流信号归入对应的tRNA种类。 此前的做法是先碱基识别再把读段比对回参考序列，而tRNA上密集的修饰会让碱基识别出错，比对时要么放宽条件牺牲准确率，要么收紧条件牺牲可用读段数。 在每种tRNA取1000条可被Guppy碱基识别的读段做比较时，ntc44分类器的平均分类准确率为99.1%、保留82.7%的读段；Minimap2平均准确率75.6%、保留72.5%，BWA-MEM准确率97.8%但只保留50.7%，Parasail保留94.4%而准确率71.2%。
把44种纯化tRNA按等摩尔混合后同时上两种平台测序，可以得到每种tRNA的读段计数偏差参数，用它校正后读段比例才接近真实的分子比例。 测序读段数不能直接换算成分子拷贝数，因为每种tRNA在不同平台上都有各自的读段偏差，而这种偏差此前难以准确估计。 等摩尔混合物中每种tRNA理论上应占约2.27%的读段，实际分布为0.5%到5.9%，两种平台之间偏差最高达5.48倍（tRNAPro2），且三次独立实验重复出现；用该参数校正后，纳米孔与Illumina对大肠杆菌总tRNA的丰度估计相关性从R2=0.23升到0.86。
校正后的流程能在一天内给出大肠杆菌全部48种tRNA的绝对丰度，并据此比较不同培养条件与修饰缺陷菌株之间的差异。 此前的tRNA测序多只能给出不同样本间的相对变化，难以直接比较不同tRNA种类之间的拷贝数。 在稳定期大肠杆菌中，最丰富的tRNAGly3占总tRNA池的7.08%，最少的tRNASec只占0.07%，相差约101倍；缺失thiI的菌株中，带s4U8修饰的tRNACys经Northern blot检测降至野生型约五分之一。
以tyCooNN为基础的二分类器可以逐条读段判断某个tRNA修饰是否存在，并估计其修饰频率。 依赖碱基识别错误的比对方法对修饰的检出灵敏度随修饰类型差别很大，s4U等修饰几乎检不出。 针对tRNAGly3第55位Ψ的二元分类器验证准确率平均96%，在按1:3、2:2、3:1混合的样本上预测比例与LC-MS测定接近，假阳性率3.5%、假阴性率4.8%，而同一批样本用比对法为19.0%和23.8%。
启示与展望
已展示的范围是大肠杆菌tRNA：44种经分离纯化的tRNA用于训练与等摩尔标定，48种tRNA的分类准确率98.2%，绝对丰度与差异分析均在实验室培养的大肠杆菌及修饰酶敲除菌株上完成。作者提出可将该方法推广到包括人类在内的其他生物，但文中未给出这类实验。
作者指出，训练好的模型不能在RNA002与RNA004化学之间直接迁移，换化学条件需从头训练；ntc48因八种等解码tRNA之间的歧义，准确率略低于ntc44；与既往方法比较时，纳米孔结果与2D-PAGE（R2=0.56）和DORQ-seq（R2=0.52）中等相关，与微阵列仅弱相关（R2=0.14），说明不同方法给出的丰度估计差异不小。