敲除结核分枝杆菌小RNA MTS0997与MTS1338后，小鼠存活期缩短而肺部菌量不变
核心概要
研究者构建了缺失MTS0997、MTS1338及双缺失的无标记结核分枝杆菌敲除株，在培养生长、IFN-γ激活或未激活的小鼠骨髓来源巨噬细胞以及高易感I/St小鼠感染三种情境下做全基因组表达谱分析，发现MTS0997缺失对细菌生物学影响更大（琥珀酸/延胡索酸呼吸改变、ESX-1分泌系统基因上调、对小鼠毒力增强、肺部促炎细胞因子产生减少），三个敲除株感染小鼠的存活期均显著短于野生型，但感染6周肺部CFU无差异，单敲除与双敲除株在肺部B细胞与MHC-II表达细胞群上的差异提示转录上位效应。
FIGURE 1 Transcriptional changes caused by sRNA KO in M. tuberculosis. (A) PCA plot showing the difference between KO strains and wild type mycobacteria. (B) Venn diagram of DEGs in KO strains compared with the wild type strain. (C) Heatmap showing DEGs related to respiratory and energy metabolism, lipid metabolism, amino acid biosynthesis, and virulence factor secretion in individual biological replicates (p < 0.05; |log2FC| ≥1). Functional groups of genes are given. (D, E) Functional category enrichment analysis of genes upregulated (D) and downregulated (E) in the double- KO strain compared to the wild type strain. Lollipop plots show significantly enriched metabolic pathways obtained using DAVID bioinformatics resources. The size of each bubble indicates the number of genes associated with the respective pathway, whereas color intensity represents statistical significance based on the false discovery rate (FDR). (F) Validation of DEGs by qRT-PCR. mRNA expression was determined in the wt_empty, dd_0997_1338_ empty, dd_0997_1338_ comp (complementation of both sRNA genes) strains in the mid-log phase and normalized to that of 16S rRNA. *p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001. The data are presented as the mean ± SD of three biological replicates for each strain.
· 第 6 页深度剖析
缺失MTS0997的菌株（d_0997）与双敲除株（dd_0997_1338）在培养生长中的转录组高度相似，均明显偏离野生型，而d_1338仅检出两个差异表达基因。 此前对这两个小RNA在分枝杆菌转录谱调控中的作用刻画不完整，本研究用无标记单敲除与双敲除株的全基因组RNA-seq直接比较，给出各缺失株的差异表达基因数量（d_1338为2个，d_0997为33个，dd_0997_1338为52个，其中30个为d_0997与双敲除株共有）。 基于RNA-seq三重复测序，差异表达阈值为校正p值≤0.01且|log2FC|≥1，PCA显示敲除株形成独立转录簇，并用qRT-PCR验证了部分基因。
MTS0997缺失伴随琥珀酸/延胡索酸呼吸相关基因改变、ESX-1分泌系统基因（espA、espC、espD等）上调以及脂代谢基因（fad11、fadE23、fadE24、lipQ）表达升高。 把此前已知的MTS0997在酸性应激下推动脂肪酸利用的表型，扩展为对呼吸方式、毒力因子分泌与脂质代谢通路的整体转录重排，并指出三个敲除株中仅succinate dehydrogenase组分Rv0247c（>10倍）与Rv0248c（7倍）共同上调。 来自培养至OD600约1.0的细菌RNA-seq与qRT-PCR验证，互补株dd_0997_1338_comp中这些基因表达回落至接近野生型水平。
三个敲除株经呼吸道低剂量（约100 CFU/鼠）感染高易感I/St小鼠后，存活期均显著短于野生型，但感染6周肺部CFU计数组间无统计学差异。 此前同一批单敲除株在静脉高剂量（约10^6 CFU）模型中的存活结果与本研究不同，作者将差异归因于给药途径与剂量；本研究同时给出存活与菌量两个读数，显示毒力表型不能由细菌载量解释。 Kaplan-Meier多组比较显示存活差异显著；互补株dd_0997_1338_comp感染组存活显著长于双敲除株（P<0.01）且与野生型无统计学差异，尽管互补似乎只是部分恢复。
感染双敲除株的小鼠肺组织中il6、il12b、ifng等促炎细胞因子基因表达降低，CD4+ T细胞数量与频率下降；而单敲除株感染小鼠肺部B细胞频率下降、MHC-II H2-A分子表达约升高2倍，双敲除株感染小鼠却无这些变化。 把细菌小RNA缺失与宿主肺部免疫细胞组成和细胞因子转录联系起来，并将单敲除与双敲除表型不一致解释为分枝杆菌中尚不清楚的转录上位效应。 基于感染小鼠肺组织qRT-PCR与流式细胞术（每只小鼠单独制备单细胞悬液，共9只小鼠），统计采用ANOVA与t检验，P<0.05为显著。
启示与展望
这项工作为在H37Rv遗传背景下分别和同时研究MTS0997与MTS1338的功能提供了无标记敲除株与互补株，以及公开的细菌与小鼠转录组数据（GEO GSE330228、GSE220660；突变株数据NCBI SRA PRJNA701202）。它适用于以小鼠骨髓来源巨噬细胞为体外模型、以高易感I/St小鼠低剂量气溶胶感染为体内模型的研究场景，也适用于关注ESX-1分泌、琥珀酸/延胡索酸呼吸与脂代谢通路的结核毒力研究者。作者指出，非SPF、非无菌饲养的“脏小鼠”表型可能更接近一般人群，而SPF动物可能给出偏差更小的结果。
本文为不完整读取，图与补充表未纳入，因此差异表达基因的完整清单、补充图表中的具体数值与统计细节无法在此核对。作者提示，体外巨噬细胞中的宿主基因表达变化不能直接外推到体内免疫与炎症通路，MHC-II在BMDM与肺组织中的相反趋势、以及CXCL1/CXCL2下调未伴随中性粒细胞浸润减少，都说明两种体系的读数需要分别解读。MTS1338的可靠靶标仍未确定，作者提出它可能作用于宿主RIG-I或MDA5等RNA传感器，这仍是待检验的假设。转录上位效应在分枝杆菌中的机制尚不清楚，单敲除与双敲除表型差异的解释因此保持开放。互补仅部分恢复低毒力表型，也提示该表型的遗传学基础仍有待进一步厘清。