从零设计连接酶把泛素挂到指定赖氨酸：PCNA第164位在45个旁位赖氨酸中仍被选中
核心概要
研究团队用RFdiffusion3从零设计出以半胱氨酸催化三联体为核心的泛素连接酶，把活化的泛素供体直接接到目标蛋白选定的赖氨酸上。在含单一赖氨酸的19残基模型肽上，48个设计中有35个表现出可测的泛素化活性，其中4个在未做实验优化时接近定量转化。换到同源三聚体PCNA后，48个设计里只有4个有活性，其中PL4只修饰K164；再引入单个N148A替换后，PL4.1在3小时内把90%的PCNA转化为泛素化产物。
深度剖析
泛素化位点现在可以由设计而非天然E3连接酶来决定：设计出的酶能识别目标蛋白上的一个赖氨酸，并把泛素以异肽键接上去。 天然泛素化依赖E1-E2-E3级联，底物识别主要由人类基因组中600多种E3连接酶承担，因此把泛素转移改道到选定的赖氨酸一直很困难；化学和半合成方法虽能制备位点明确的泛素偶联物，却常需要繁琐合成与蛋白重折叠。 在含单一赖氨酸的19残基模型肽上，48个设计中有35个表现出可测的泛素化活性，覆盖11个骨架中的10个；MPL16、21、29和40在过夜反应中接近定量地把Ub-MESNa转移到肽上，且几乎没有额外水解供体。
同一套设计流程可以从肽识别扩展到球状天然蛋白，并在一个赖氨酸与45个旁位赖氨酸之间做出选择。 PCNA三聚体带有三个对称相关的K164位点和另外45个赖氨酸，K164周围表面极性很强、缺少可锚定的疏水斑块，邻近环在晶体结构中部分未解析，识别难度明显高于模型肽。 48个PCNA设计全部可溶表达，其中4个能泛素化PCNA；PL4对K164R突变体没有可检测的泛素化，而PL3、PL14和PL19仍保留部分脱靶活性。
把设计连接酶与E1依赖的供体活化偶联，可以直接从非活化泛素出发完成位点特异泛素化，并装上长度确定的泛素链。 此前制备位点特异泛素化PCNA往往需要大量实验投入，而已有的工程化泛素结合酶Ubch5c S22R在类似E1偶联条件下修饰PCNA更慢，并产生多种泛素化产物。 在200 µM泛素、100 µM PCNA和10 µM连接酶条件下，PL4.1经24小时把约90%的PCNA转化为泛素化产物，Ubch5c为60%；PL4.1还能把线性M1连接的二、三、四泛素链转移到K164，PCNA转化接近定量。
启示与展望
已展示的范围是体外反应：模型肽、SUMO-肽融合体与人PCNA，使用Ub-MESNa或E1加ATP与MESNa原位生成活化供体，并给出PL4.1的1.6 Å晶体结构；作者提出把设计连接酶送入细胞是后续方向，但未报告细胞内结果。
作者报告PCNA的48个设计只有4个有活性，并把瓶颈归于酶-PCNA界面上底物精确定位困难；PL4中设计的N148侧链在预测结构里错位，两个设计的氧负离子洞相互作用都未形成，去除该残基反而使活性提高约26倍。PL4.1对酵母PCNA无可检测活性，说明识别依赖界面的具体特征而非整体折叠。