Perturb-seq 常把针对同一靶点的多条向导RNA当作重复样本合并，但向导的脱靶效应会让靶点层面的估计带上偏差。PETRO 假定每个结果中多数向导是有效的，用稳健加权把与多数不一致的向导降权，从而在不删除向导、不使用序列注释的情况下估计靶点扰动效应。在 RPE-1 CRISPRa 数据中，最长种子匹配为13–18 bp的靶点—结果对上，合并的平均偏差为0.087，PETRO 的残余偏差为0.005；模拟中合并的偏差随细胞数增加仍停留在约0.075，PETRO 则降到接近零。
针对同一靶点的多条向导RNA被合并成一个靶点标签后，靶点层面的扰动效应估计仍会混入向导自身的脱靶效应，即使这些向导确实有效敲低或激活了目标基因。 此前的常规做法是把携带同一靶点向导的细胞合并，或对向导效应取平均；这种做法只有在各向导脱靶效应按权重相互抵消时才能消除偏差，否则增加细胞数只会让一个有偏的估计更精确。 在 RPE-1 CRISPRa 数据中，以启动子近端种子匹配长度作为独立于表达响应的脱靶风险基准，向导层面平均偏差从9 bp的0.024升到11 bp的0.194和13–18 bp的0.460；对最长匹配为13–18 bp的靶点—结果对，合并后的靶点层面平均偏差为0.087，约为向导层面偏差的19%，接近最长匹配向导平均18%的合并权重。
PETRO 把靶点层面的估计改成对向导效应做按结果分别加权的稳健汇总，让与多数向导不一致的少数向导自动降权，而不是把它们从所有结果中删除。 PETRO 采用多数规则：对每个靶点—结果对，假定超过一半的向导有效，此时靶点扰动效应等于向导效应的中位数，无需知道哪些向导有效；实现上用 Tukey 双平方权重的稳健 M 估计，权重按结果分别计算。 在 RPE-1 未过滤的向导效应上，PETRO 把13–18 bp 层的平均靶点层面偏差保持在0.005附近；在 K562 CRISPRi 中，对 Drepanos 等独立标记的7条滥交向导，PETRO 对靶点扰动效应的传递在 day 7 为0.091、day 10 为0.111（合并归一为1），且拟合时未使用这些标记。
在模拟中，当四条向导里有一条带脱靶效应时，合并的偏差不会随细胞数增加而消失，PETRO 的偏差则趋近于零。 在 Γ=0、δ=0.30 的设定下，每向导细胞数从150增至750，合并的偏差维持在约0.075，PETRO 的偏差从0.032降到约 −1.78×10⁻⁴。 该比较来自每条件10,000次重复的四向导模拟，其中三条向导有效、一条带未知脱靶效应；在 Γ=0、δ=0.80、每向导150个细胞的条件下，合并的偏差为0.20，向导中位数为0.035，PETRO 为5.37×10⁻⁴。
该方法面向标准的多向导 Perturb-seq 分析，输入是上游模型给出的向导层面效应估计及其协方差，因此上游可用线性、负二项或伪批量 DESeq2 等模型；在 RPE-1、Hs27、A375 CRISPRa 与 HEK293FT、K562 CRISPRi 数据以及四向导模拟中做了评估。原文指出，容忍至多 k 条无效向导需要每个靶点至少 2k+1 条向导，奇数向导数在该准则下更节省重复。
多数规则是识别假设，一般无法仅从观测到的向导效应验证；若至少一半向导无效，尤其当无效向导彼此一致时，PETRO 可能无法恢复靶点扰动效应。有限样本中小脱靶效应难以与抽样噪声区分，共同效应模型与比例扩展也未必适合每个靶点—结果对。ZNF219 三条向导分歧的原因尚未确定，数据也不能判定哪条向导的表型代表 ZNF219 的生物学效应。
