环境宏基因组里挖出逾4.6万个潜在β-内酰胺酶，两个低同源候选在大肠杆菌中赋予多重耐药
核心概要
环境微生物组中β-内酰胺酶的功能多样性与突变潜力此前只被部分认识。把蛋白质语言模型与集成学习结合，从环境宏基因组中识别出四个Ambler类共逾4.6万个潜在β-内酰胺酶，其中与已知酶序列同一性约30%的两个C类候选在大肠杆菌中表达后赋予对多种β-内酰胺类抗生素的耐药性；再用逆折叠模型与蛋白质语言模型筛出的突变可改变耐药谱，包括增强对碳青霉烯类的耐药。
深度剖析
环境宏基因组中的β-内酰胺酶不再只靠与已知序列的相似性来寻找，而是由蛋白质语言模型编码的序列特征配合集成分类器在四个Ambler类中统一识别。 此前的同源搜索和谱模型方法在候选序列与已表征蛋白差异很大时效果受限，环境酶的功能多样性因此长期只被部分刻画。 在1,778条已表征β-内酰胺酶序列上做五折交叉验证，五个基分类器各自表现良好但各折预测有波动，集成模型在所有折上正确分类了每一个验证样本。
从MGnify蛋白数据库挖出的候选遍布全球陆地与海洋生境，且类别构成与已知参考序列不同。 已表征的β-内酰胺酶以A类为主，而环境候选在B类和C类上显示出更大的多样性与丰富度。 候选数量按地区分布不均，北美14,099条、亚洲11,248条、欧洲10,665条，B类在各地区均占34.0%至44.5%。
两个与已知酶同一性约30%的C类候选Prot22和Prot94在大肠杆菌中表达后确实赋予耐药性，说明预测到的远缘序列具有真实酶活。 空载pET26b对照菌株对所测抗生素和抑制剂组合没有明显耐药，仅呈低水平耐受。 Prot22对青霉素、苯唑西林、氨苄西林和阿莫西林/克拉维酸的MIC均超过256 μg/mL，Prot94对青霉素的MIC最高，为512 μg/mL，但对抑制剂组合更敏感。
把结构约束的ProteinMPNN与进化信息的ESM1b合用，可以筛出改变耐药谱的单氨基酸替换。 野生型Prot22本身没有碳青霉烯类耐药表型，而突变体Mut2（Y106F）获得了这一表型。 Prot22的Mut2对美罗培南MIC为2 μg/mL、对亚胺培南为16 μg/mL；Prot94的Mut5（S73T）对头孢克洛和亚胺培南的MIC均为512 μg/mL。
启示与展望
已展示的范围是：从MGnify蛋白数据库2024_04版本挖掘候选，并在大肠杆菌中以MIC测定验证两个C类候选Prot22和Prot94及若干单点突变体；作者提出后续需要更广的实验验证、实验演化与环境分辨的宏基因组数据。
作者指出集成学习框架对高度分化蛋白的泛化能力仍需验证；实验表征只覆盖两个C类候选，耐药主要靠MIC测量；突变预测只用有限数量的单点替换评估；生态比较依赖现有宏基因组序列而非直接测量选择压力。作者还说明，预测的高适应度位点熵更高不能直接解读为正选择证据，且预测突变与自然优势残基的对应比例在海洋来源约25%、废水来源约30%，差异在合并与分类分析中均不显著。