稳定性预测不再自相矛盾：EvoPhi-DDG把进化比对模型改成势差，正反预测严格反号
核心概要
蛋白质稳定性变化预测器常给出前后不一致的结果：交换突变前后两条序列，预测值并不严格反号，同一突变位点经不同中间状态绕行也难闭合。EvoPhi-DDG在不重新训练的前提下，把基于家族比对的MSAesm_ddG改写为以突变位点和比对上下文为条件的有效势之差，使正反预测严格反号、固定比对上下文下同一位点严格可加。它与已发表的JanusDDG等权平均后，在S669上Pearson相关为0.59，高于JanusDDG的0.55和EvoPhi-DDG的0.53。
深度剖析
稳定性变化预测现在可以做到正反严格反号，并在固定突变位点与比对上下文下严格满足路径可加，而预测精度基本不变。 原始MSAesm_ddG在S669上正反预测之和的平均绝对偏差为0.20 kcal/mol，最大偏差1.19 kcal/mol，自身对自身的预测为−1.38×10⁻³ kcal/mol而非零；九个中间残基时直接预测与路径求和的Pearson相关从0.96降到0.84，闭合RMSE从0.26升到0.61 kcal/mol。 在S669的669个直接变体上，反号化后的MSAesm_ddG把正反偏差和自身预测偏差精确消为零，九个中间残基时直接与路径相关的Pearson为1−1.38×10⁻⁶，闭合RMSE为1.50×10⁻³ kcal/mol；S669的Pearson由0.54变为0.53，S96由0.47变为0.48。
做法是把已有的比对条件预测头改写成两个序列各自的有效势之差，不需要任何额外训练。 具体做法是让同一套参数在两个突变方向上各算一次并取差值的一半，再把预测头的隐藏偏置置零；隐藏偏置置零后，ReLU头在反号化后化为输入的线性泛函，中间状态的贡献在求和时相互抵消。 隐藏偏置置零在S2450上只带来平均5.84×10⁻⁴ kcal/mol、最大2.88×10⁻³ kcal/mol的预测变化；多位点替换则通过在野生型背景和全突变背景上分别对每个替换及其回复打分、再对整体变体反号化来扩展，在PTmul-NR的82个变体上保持Pearson 0.66、MAE 1.45 kcal/mol、RMSE 1.95 kcal/mol。
启示与展望
演示范围限于S669、S461、S96三个单替换基准和PTmul-NR多位点基准，全部使用已发表检查点、固定比对上下文与同一批随机路径，未做额外训练、打分校准或集成拟合；精确可加性只在固定突变位点与比对上下文下成立。
多位点路径上的闭合误差仍然存在，因为读出依赖突变位点，固定位点的势无法在不同位点间定义统一势；PTmul-NR只有13条野生型序列，比较对样本敏感；S461只有23个稳定化变体；S96上集成相对JanusDDG的Pearson提升区间跨零。