单细胞参考能改写结论：CD8 T细胞年龄关联在全部80个六型参考中反号

用单细胞参考从批量转录组反推细胞比例时，参考会把自身误差带进下游关联分析，足以让关联反号或凭空变显著。 此前的基准比较的是不同参考、规模、平台与状态分辨率下的比例估计精度，没有检验参考是否改变最终得出的关联结论，也没有考察参考细胞在各供体间的分布。 在981名OneK1K供体中，标记比例给出的CD8 T细胞年龄斜率为每年−0.072个百分点（t=−2.6），而80个六型参考反推的斜率全部为正，介于每年+0.04至+0.24，其中96%的|t|>1.96；CD4 T细胞斜率被放大5至8倍，使原本不显著的t=−1.6趋势在每个参考中都变显著。

这种误差来自参考而非拟合器，但胰岛误差的方向由估计器类别决定，同一参考在不同估计器下给出不同结论。 CD8反号与CD4放大在MuSiC加权、MuSiC非负最小二乘、CIBERSORT型ν-SVR和InstaPrism四类估计器中都重现。 在117个胰岛参考集上，三类回归型估计器把α细胞斜率放大1.11、1.43和2.06倍，分别在117、95和46个参考集中判为显著；InstaPrism则把斜率衰减到0.59倍，仅在6个参考集中显著。

参考误差分两部分：随协变量移动的系统部分只能靠分辨状态漂移的参考消除，随机部分可用供体内的供体自助法测出并并入置信区间。 批量样本算出的置信区间不包含参考侧供体抽样带来的不确定性，小参考中这一波动可与批量侧标准误相当。 在三个供体的OneK1K参考中，CD8 T细胞斜率的参考侧波动是批量侧标准误的1.9倍，NK细胞为1.3倍；在15至30个供体时降到0.5至0.8倍。供体自助法得到的标准差是八个独立供体集间标准差的0.77至1.49倍（中位数1.07）。

供体抽样是可修正的部分：等供体平均与按细胞合并是同一个精度加权估计器的两个极限，阈值n*=1/ρ可从参考自身估计。 公共参考普遍偏薄，226个CELLxGENE数据集中60%存在某细胞类型的中位供体贡献不足10个细胞。 在336个三供体PBMC参考中，各类型的n*为9至17个细胞；把精度权重插入未改动的MuSiC 1.0.0后，60个细胞每型时加权MuSiC的10:1:1分配惩罚从+0.591降到+0.322个百分点，即降低45%，模型预测为48%。

结论建立在两个与参考共享平台和注释的伪批量队列上：981名OneK1K供体的PBMC与48名胰岛供体，配合226个公共参考的普查和冻结网格重拟合；真实批量队列GSE50244中参考与批量谱不匹配，β细胞在供体设计起作用之前就已不可识别。

两个队列都是伪批量，与参考共享平台和注释，这会低估系统偏差；OneK1K的真值继承Azimuth标签噪声。模型在每型只有两个细胞供体时不成立，也未解释稀有状态的高估和胰岛残差的来源。SVR类用的是EpiDISH对CIBERSORT流程的实现而非CIBERSORTx本身，InstaPrism由发布源码转写且未与编译包核对。